Perkembangan Teknik Hibridoma

PRINSIP PEMBUATAN ANTIBODI MONOKLONAL
Tujuannya ialah menciptakan sel pembuat antibody homo- gen yang dapat dibiakkan terus menerus (immortal), melalui :
1) Fusi sel limpa kebal dan sel mieloma
Pada kondisi biakanjaringan biasa, sel limpa yang membuat antibodi akan cepat mati sedangkan sel mieloma dapat dibiakkan terus menerus. Fusi sel dapat menciptakan sel hibnd yang membuat antibody seperti sel timpa dan dapat dibiakkan terus menerus seperti sel mieloma (9,10,11)

2) Eliminasi sel induk yang tidak fusi
Frekuensi terjadinya hibrid sel timpa-sel mieloma biasanya rendah, karena itu penting untuk mematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnya lebih banyak agar sel hibrid mempunyai kesempatan untuk tumbuh, dengan cara menggunakan:
(i) Sel mieloma mutan yang mempunyai kelainan (defect) sintesis nukleotida yaitu sel mieloma yang tidak mempunyai enzim timidin kinase (TK) atau hypoxanthine phosphoribosyt transferase (HGPRT) sehingga dalam sintesis nukleotida tidak dapat menggunakan salvage pathway dan
(ii) Media selektif yang dikembangkan oleh Littlefield, me- ngandung hypoxanthine, aminopterin dan thymidine (HAT). Aminopteninmenghambatjalan biasa biosintesis purin dan piri- midin sehingga memaksa sel menggunakan salvage pathway. Sel yang tidak fusi karena tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthine phosphonibosyttransferase akan mati, se- dangkan sel hibrid karena mendapatkan enzim tersebut dan sel mamalia yang difusikan dapat menggunakan salvage pathway sehingga tetap hidup dan berkembang (10,12).
3) Isolasi Mon yang diinginkan
Sel hibrid dikembang biakkan sedemikian sehingga tiap sel hibrid akan membentuk kotoni sendiri. Tiap koloni kemudian dipelihara terpisah satu sama lain. Hibridoma yang terbentuk di- pilih dengan cara mendeteks antibodi yang disekresikan dalam medium. Kadarantibodi biasanya cukuptinggi, sehingga banyak uji serologi yang dapat digunakan tergantung jumlah antigen spesifik yang tersedia, tetapi yang paling sering digunakan adalah radioimmunoassay (RIA) dan enzyme linked immunosorbent assay (EL1SA).
4) Produksi antibodi monokional spesifik
Setelah klon hibridoma yang diinginkan dapat diisoiasi, maka produksi antibodi monokional dapat dilakukan dengan cara :
(i) in vitro, membiakkan pada medium biakan jaringan dan antibodi dapat dipanen dan supernatan. Kadar pada umumnya 10?100 ug/ml supernatan,
(ii) in vivo, mentranspiantasikan intraperitoneal pada binatang, antibodi dipanen dan cairan asites. Kadar pada umumnya 1-25 mg/ml cairan asites (10,12) .
PERKEMBANGAN TEKNIK HIBRIDOMA
Sejak diperkenaikan, teknik hibridoma telah banyak mengalami perkembangan untuk mendapatkan klon secara efisien dan hibridoma yang hidup secara maksima (13) . Sejalan dengan tujuan maka pengembangan timbul pada cara-cara:
1) Imunisasi
Hibridoma merupakan hasii fusi 2 sei yaitu sd mieioma dan sel B penghasii antibodi. Karena itu supaya memperbanyak sel B spesifik terhadap antigen yang diinginkan penting supaya popu- lasi sel B pesifik jumlahnya lebih banyak sehingga hasil fusi mencapai maksimal. Banyaknya sel B spesifik dipengaruhi anti- gen baik caranya stimuiasi maupun sifat dan antigen sendiri, Se- hingga untuk memperbanyak sel B spesifik, dilakukan berbagai cara imunisasi, yaitu:
(i) Konvensional
Cara ini sebenarnya sama dengan cara imunisasi untuk membuat antibodi poiikional. Antigen berupa protein atau poli- sakanida dalam volume yang sama diemulsikan dengan complete Freuncfs adjuvant, bila antigen seluier dibuat tanpa ajuvan. Antigen disuntikkan subkutan pada beberapa tempat atau intra- peritoneai, setelah 2?3 minggu disusul suntikan antigen tanpa ajuvan secara intravena sekali atau beberapa kaii. Mencit dengan tanggap kebal terbaik dipilih, 1?2 hari setelah suntikan terakhir mencit dibunuh dan diambil sel limpanya (11,12) . Cara ini dianggap cukup baik dan secara umum banyak dipakai, walaupun di- pengaruhi sifat antigen berupa imunogen kuat atau lemah serta tanggap kebal binatang yang berbeda-beda. Bila informasi anti- gen yang iengkap tidak bisa didapatkan cara imunisasi ini ter- bukti memberi hasil cukup baik (11) ..
(ii) Imunisasi sekali suntik intralimpa (Single-shot intrasplenic immunization) Pada imunisasi konvensional, antigen dipengaruhi ber- macam-macam faktor. Bila disuntikkan ke dalam darah sebagian besar akan dibuang secaraaiami, sedangkan melalui kulit akan tersaring kelenjar limfe regional, makrofag dan sel retikuler. Hanya sebagian kecii antigen yang terlibat daiam proses tanggap
kebal. Pada hibridoma yang diperlukan adalah sel limpa, karena itu untuk mencegah eiimin antigen oleh bagian lain dari tubuh dilakukan suntikan imunisasi langsung pada limpa dan ternyata hasilnya lebih baik dan cara konvensional (14) . Selain memberi- kan hasil klon spesifik yang lebih banyak, imunisasi intraiimpa ini memberi keuntungan yang lain :
(1) Pemakaian antigen yang sangat hemat, misalnya untuk imunisasi dengan 1gM manusia hanya diperiukan 20 ug, sedangkan untuk antigen berupa sel hanya diperlukan 200.000 sel, sehingga dapat dibuat hibridoma dan antigen yang terbatas jumiahnya. Karena hampir semua binatang percobaan membeni tanggap kebal yang baik, tidak di- periukan binatang dalam jumlah yang besar (14) .
(2) Fusi dapat dilakukan dalam waktu 3 hari seteiah imunisasi (14) .
(iii) Imunisasi in vitro
Tidak ditemukannya antibodi monokional spesifik sering karena kegagalan stimulasi limfosit B pada imunisasi in vivo. ini mungkin disebabkan toleransi atau adanya antigen hierarchy response (reaksi tanggap kebai hanya terhadap beberapa kom- ponen antigen). Sering terjadi seteiah imunisasi dengan antigen yang Iemah, wataupun titer antibodinya tinggi ternyata gagal mendapatkan hibridoma spesifik karena rendahnya jumtah sel B spesifik dalam limpa, maka untuk mengatasinya dilakukan imunisasi in vitro (15) Pada prinsipnya sel timpa belum imun ditambah antigen dan TCM (thymocyte culture-conditioned medium) yaitu medium biakan sel thymus setelah inkubasi 48 jam. Antigen dapat benupa antigen tertarut sebanyak 30?1000 ug atau sel yang difiksasi aikohol atau yang diradiasi 4500 rad dengan Cesium radioaktif. Setelah diinkubasikan 37?C selama 5 hari akan banyak dijumpai sel blast yang besar dan pada keadaan ini sel siap untuk dilakukan fusi (15) Sebagai contoh kebenhasiian imunisasi in vitro : melalui imunisasi in vitro dengan 107 sel acute myeloid leukemia (AML) yang difiksasi alkohol, 31 dan 96 sumur biakan menghasilkan hibridoma spesifik dan antibodi dan 6 dari klon ternyata sangat spesifik karena tidak beneaksi dengan sel darah penifer maupun sel sumsum tuiang. Hasil ini berbeda bila dibandingkan melalui imunisasi in vivo, antibodi yang dihasiikan sebagian besar bereaksi dengan major histocompatibility antigen atau major rnyeloid differentiation antigen yang merupakan bagian terbanyak dari permukaan sel (15) . Perkembangan selanjutnya merupakan penyederhanaan kon- disi imunisasi in vitro yaitu menggunakan medium yang biasa untuk biakan jaringan yaltu RPMI (Roswell Park Memorial Institute) atau DMEM (Dulbeco `s Mod Eagle's Medium) dan ajuvan peptida yang mudah didapat, N-acetytmuramyl-L-alanyi- D-isoglutamine. Cara ini terbukti telah meningkatkan jumlah hibridoma pembuat antibodi sertajumlah hibridoma yang dapat
bertahan hidup. Pada pninsipnya cara ini sama dengan di atas, yaitu sel limpa beium imun ditambah antigen dan 20 ug N- acetylmuramyi-L-alanyi-D-iso- glutamine, diinkubasikan 37?C dengan 5% CO 2 95% udara setama 4 hari (16) . Berhasilnya imu- nisasi in vitro ini telah membuka petuang dilakukannya stimulasi in vitro sel B manusia, karena imunisasi in vivo tidak dapat di- jaiankan karena dibatasi etika, yang seianjutnya diikuti fusi dengan sel mieloma manusia atau transformasi dengan virus Epstein-Barr sehingga dapat dibuat antibodi monoktonat ma- nusia(16) .
2) Pilihan sel mieloma
Yang rnenjadi pertimbangan dalam memilih sel mieloma, adalah:
a) Spesies
Sd mieloma yang berasal dari spesies yang sama dengan binatang yang diimunisasi akan mengurangi segregasi kromo- som pasca fusi. Contoh yang ekstrim ialah hibridoma sel mieloma mencit dengan sel limpa manusia,kromosom sel manusia dengan cepat mengalami segregasi sehingga hasil hibrid menjadi tidak stabi1 (11,17) . Dalam perkembangannya, pemilihan sel mieloma yang berbeda spesies dapat dilakukan terutama untuk tujuan ter- tentu. Hibrid sel mencit dengan tikus telah dibuat dan berhasil baik, tetapi perbedaan spesies yang terlalu jauh dikatakan tidak produktif (18) . Walaupun pembuatan antibodi monokional mencitdan tikus sudah berhasil baik, gunanya secara klinis sangat terbatas karena tetap merupakan protein asing untuk manusia. Karena itu dikem- bangkan hibrid manusia dengan mengembangkan sel mieloma manusia yang sensitif terhadap hypoxanthinc-aminopterin- thymidine. Tim dari Stanford University telah berhasil membuat galur sel mieloma tersebut yaitu U-266 AR1 dengan nomor registrasi SKO-007. Sayangnya galur ini masih membuat sendiri IgE (19).
b) Sintesis imunoglobulin
Sel hibridoma mengekspresikan rantai imunoglobulin se- cara codominant, sehingga imunoglobulin dan sel mieloma akan diekspresikan bersama imunoglobulin dan sel limpa dengan kombinasi secara acak (19). Sebagai contoh, bila sel mieloma membentuk rantai berat dan rantai ringan imunoglobulin, seperti juga halnya dengan sel limpa, maka imunoglobulin dan sel hibrid merupakan kombinasi acak dari ke-4 rantai dan antibodi spesifik hanya terdapat 1/16 dari seluruh imunoglobutin yang terben- tuk (20) . Karena itu pengembangan diarahkan untuk membuat sel mieloma yang tidak membuat rantai imunoglobulin tetapi tetap dapat fusi dengan baik. Gatur sel mieloma mencit SP2/O-Ag14 yang merupakan hasil reclone SP2/HI-Ag adalah sel mieloma pertama yang tidak membentuk rantai imunogtobutin (20) . Ber- bagai jenis mieloma dapat dilihat pada Tabel 1.

3) Medium biakan
Medium biakan umumnya DMEM atau RPMI 1640 dengan tambahan fetal calfserum (FCS) dan aditif lainnya. Yang menjadi masalah adalah FCS harganya mahal, sutit didapat dan kuali- tasnya sangat bervariasi tergantung sumbernya bahkan juga bervariasi untuk tiap batch. Penambahan FCS sangat penting, bahkan pada waktu fusi, seleksi dan cloning kadar FCS dalam medium sering dinaikkan. Dipilih FCS karena kandungan imunogtobulinnya rendah sehingga tidak mempengaruhi assay serta sangat mendukung tumbuh dan kembang biak sel (11) . Usaha pengembangan dilakukan untuk mendapatkan me- dium tanpa serum karena memberi keuntungan: ? memungkinkan penetitian yang tak memperbotehkan adanya protein serum atau bahan-bahan dan serum misatnya hormon, antibodi. ? ekonomis, terutama untuk menumbuhkan sel dalam skala besar. ? mempermudah pemurnian antibodi monokional, bahkan pada beberapa keadaan, antibodi monokional dapat langsung digunakan tanpa pemurnian (21) . Salah satu dari medium tanpa serum adalah Serum-free KSLM medium yang menggunakan medium dasar RPMI 1640 + DMEM + Hams F-12 medium dengan perbandingan 2: 1: 1, ditambah insulin, 2-amino etanol, 2-merkaptoetanot, natrium selenit, LDL manusia, asam oleat dalam kompleks dengan albumin serum sapi (BSA) (22) . Serum- free KSLM medium terbukti sama baiknya untuk menumbuhkan sel mieloma NS- 1 dan sel hibnidoma (Tabet 2), dibandingkan medium dengan 10% FCS. Harus menjadi perhatian bahwa tidak semuajenis sel mieloma atau hibridoma cocok dengan medium tanpa serum (21) .
4) Fusi sel
Fusi sel diawali dengan fusi membran plasma sehingga menghasitkan sel besar dengan dua atau lebih inti yang berasal dari kedua induk sel yang berbedajenis, disebut heterokaryon, pada waktu tumbuh dan membelah diri terbentuk 1 inti yang me- ngandung knomosom kedua induk disebut sebagai sel hybrid (17) .
Frekuensi fusi dipengaruhi bermacam?macam faktor:
? jenis medium.
? perbandingan jumtah sel timpa dengan sel mieloma.
? jenis sel mieloma yang digunakan.
? bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen), misainya polyethylene glycol (23) .
Secara garis besar fusogen dibagi menjadi 2 kategori:
? Virus berselubung. Yang sering digunakan adalah virus Sendai (17,24) .
? Reagensia tipofitik atau tipolitik, misal lysole cithin dan polyethylene g1ycol (17) .
Pada awal penelitiannya Kohier dan Milstein menggunakan virus Sendai yang inaktif sebagai fusogen (3) , tetapi karena sulit menyiapkannya, efisiensinya sangat bervariasi dan hanya men- dorong fusi pada beberapa jenis sel saja, maka fusogen diganti dengan polyethylene glycol yang lebih mudah didapat dan dapat mendorong fusi pada sel dengan jenis yang lebih luas (17) . Pengem- bangan fusi sel banyak diarahkan untuk menaikkan efisiensi fusi yang dianggap masih rendah, antara lain dengan cara: ? mengembangkan fusogen Polyethyleneglycol (PEG) secara luas sudah digunakan se- bagai fusogen, biasanya dengan berat molekul 1000?6000, kon- sentrasi 50%. Penambahan PEG dengan DMSO (dimethylsul- phoxide) ternyata dapat menaikkan efisiensi fusi (17) . ? mengembangkan teknik fusi lain,yaitu menggunakan medan listrik pada limfoblas (25) .
5) Penumbuhan hibndoma
Berdasarkan pengamatan Fazekas de St Groth dan Schei- degger, penumbuhan hibrid pasca fusi yang dilakukan dengan feeder cell (sel limpa tidak imun) memberi hasil yang lebih konstan dibanding tanpa feeder cell (18) . Sebagai feeder system dapat digunakan sel limpa tidak imun, thymocyte, makrofag peritoneum, fibroblas manusia yang telah diradiasi (18), lipopoli- sakarida (LPS), supernatan makrofag, supernatan biakan endotel manusia dan serum darah tali pusat manusia (13) . Dalam feeder system terdapat faktor pendorong penumbuhan sel, sebagai con- toh: ? mitogen lipopolisakarida (LPS), efeknya diperkuat dengan penambahan dextran sufat. ? supernatan makrofag mengandung monokin (interleukin-1) menimbulkan aktivasi limfosit. ? supernatan biakan endotel pembuluh darah manusia dapat mendorong proliferasi dan diferensiasi hibridoma sel B, faktor mitogennya sampai sekarang betum diketahui. Demikian juga dengan serum tali pusat manusia yang sampai saat ini belum
diketahui faktor yang mendorong tumbuhnya hibridoma (13) . Penambahan feeder system terbukti menaikkan frekuensi sel limpa pembentuk klon dan frekuensi terbentuknya klon yang membuat antibodi setelah fusi (Tabel 3)
(13)
KESIMPULAN
Hibridoma merupakan fusi sel limfosit B dengan sel mieloma, yang dapat dibiakkan terus menerus. Karena hibridoma sel limfosit B tetap mempertahankan ekspresi gen imunoglobulin maka dimanfaatkan untuk membuat antibodi monoklonal. Frekuensi timbulnya hibrid setelah fusi sangat rendah, karena itu pengembangannya banyak diarahkan untuk menaikkan frekuensi fusi dan mendapatkan klon hidup secara maksimal. Cara imunisasi konvensional memberi hasil cukup baik, tetapi cara imunisasi sekali suntik intratimpa dan in vitro mem- beri hasil lebih baik, lebih hemat antigen serta waktunya lebih singkat, bahkan imunisasi in vitro membuka peluang dilakukan- nya imunisasi limfosit B manusia, dimana imunisasi in vivo tidak dapat dilakukan karena dibatasi etika. Pilihan sel mieloma makin beragam, baik spesies (mencit, tikus, manusia) maupun sifatnya, makin ideal untuk membuat antibodi monokional dengan dikembangkannya galur sel mieloma yang tidak membentuk rantai imunogtobulin. Medium dasar ditambah FCS (fetal calf serum) secara umum cukup baik, tetapi FCS merupakan hambatan karena harganya mahal, sulit di- dapatkan serta hasilnya bervariasi. Karana itu dikembangkan medium tanpa serum sehingga penelitian yang perlu keadaan tanpa serum dapat dilakukan dan biaya pemeliharaan sd dalam skala besar akan lebih murah. Untuk mendorong timbulnya fusi sel banyak digunakan polyethyleneglycol (PEG) yang mudah didapat dan cukup efek- tif. Pengembangan dilakukan untuk memperbaiki frekuensi fusi dengan menambahkan DMSO bersama PEG dan penggunaan medan listnik. Penambahan bermacam-macam feeder system, terbukti dapat mendorong penumbuhan hibridoma.